【文献解析-人|急性心肌梗塞|lncRNA】通过lncRNA-mRNA竞争性内源RNA调控网络对缺血再灌注损伤中转录调控的研究

  • 2019-12-10 13:45:16
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关键词:Acute myocardial infarction, ceRNA, GTF2H4, lncRNA

英文题目:LncRNAmRNA competing endogenous RNA network depicts

transcriptional regulation in ischaemia reperfusion injury

 

  名:Journal of Cellular and molecular Medicine

发表时间:2019.05   IF4.65

作者单位复旦大学

测序产品:lncRNA转录组             

样品来源:经皮冠状动脉介入治疗后0h2h12h24h以及72h的急性心肌梗塞患者外

文章类型:研究型

 

英文摘要:


     The study aimed to investigate time-course transcriptomes in myocardial ischaemia reperfusion injury (IRI) via RNA-Seq. Transcriptomes of 10 samples derived from patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction (ASTEMI) who were assigned to percutaneous coronary intervention (PCI), were sequenced at the time of 0 (before PCI), 2, 12, 24 and 72 hours after PCI, respectively. Using the genefilter package in r, wgcna and stem, different expression lncRNA (DEL) and mRNA (DEM) were analysed. Out of 756 mRNAs and 206 lncRNAs shared by enrolled patients, 135 RNAs were screened to be significantly associated with the IRI. Furthermore, combined with lncRNA-mRNA, lncRNA-miRNA and miRNA-mRNA network, 51 RNAs and 131 relationship pairs were ascertained in the competing endogenous RNAs (ceRNA) network. Among these nodes, SH2D3C and GTF2H4 were significantly enriched in cellular response to stress and their interaction module were isolated from functional ceRNA network. Subsequently, their critical role was confirmed via down-regulation of SH2D3C and GTF2H4 expression in vitro model. These results identified that lncRNA-mRNA ceRNA network, associated significantly with IRI, functioned as critical regulative pivotal roles after PCI-AMI, and SH2D3C and GTF2H4 may be the most responsive transcriptional regulator in the early-phase of IRI.

 

研究背景:

 

本研究通过转录组测序在探索心肌缺血再灌注损伤时间序列的转录调控信息。通过对10例经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的急性ST段抬高型心肌梗塞(ASTEMI)患者的心肌细胞,分别在PCI0小时、PCI术后2小时、12小时、24小时和72小时进行转录组测序,且利用Rgenefilter包、WGCNA和STEM分析差异表达的lncRNA (DEL)mRNA (DEM)。对患者测序共获得756mRNA206个lncRNA,其中135RNAs与缺血再灌注损伤紧密相关。此外结合lncRNA-mRNA, lncRNA-miRNA 和miRNA- mRNA网络,在竞争性内源网络中筛选出51RNAs131关系对在所有的关系对中,SH2D3CGTF2H4显著富集在细胞应激响应,且它们之间相互作用的模块远离功能性ceRNA网络;接着,在体外模型中下调SH2D3CGTF2H4的表达,证实该关系对发挥着关键作用。这些结果表明与IRI显著相关的lncRNA-mRNA ceRNA网络在PCI-AMI后发挥着重要调节作用,且SH2D3CGTF2H4可能是IRI早期阶段响应最快的转录调控因子。

 

实验设计

 





研究结果

 

1. 测序数据质控比对及样本间表达量分析

 

分别对两组患者的血液进行rRNA的链特异性测序,将测序后的序列比对到人类参考基因组进行注释分析,其中mRNA85.54%,lncRNA2.12%(图1A-B);此外组样本进行相关性分析,相关性热图显示每两个样本间的决定系数R2 在0.731 到 0.886之间(图1C),同时样本间PCA分析结果显示,每组样本均聚集在一起;接着基于lncRNAmRNA的表达量对两组处理不同时间节点间的样本进行聚类分析,结果显示不同节点样本间基因表达差异较大(图1,E-F)。

 




1 两组样本测序数据质控及样本间表达量分析

 

2.DEGs聚类和注释富集分析

 

通过样本间聚类分析,我们知道两组样本在不同时间点中的基因表达差异较大,其中存在267DELs1154DEMs(图1E-F);为了进一步获得样本间差异表达的mRNAlncRNA,对两组样本在不同时间点的mRNAlncRNA进行聚类分析,venn分析显示206DELs756DEMs在两组样本中均差异表达(图2B);接着对两组样本中共表达的mRNAs进行GOKEGG富集分析,结果显示该部分基因富集在16个生物过程和17KEGG通路(图2,C-D)。

 






2两组样本表达量分析中lncRNA(左) 和mRNA(右)的聚类热图

 

3.WGCNA和时序分析

 

为了获得与缺血再灌损伤相关的差异表达基因,将获得的206DELs756DEMs进行WGCNA分析;首先对数据进行预处理,将软阈值为6时对应的模块数据用于模块与表型之间的相关性分析,此时的数据符合无尺度分布(图3,A);通过设置每个模块中最少基因数目20,模块之间的聚类距离0。95以及模块成员与向量基因之间的最小相关系数0。8等参数构建模块识别分类树,该树根据基因表达趋势进行模块划分,共获得10个模块,其中树枝代表一个基因,每种颜色代表一个模块(图3,B) 接着对模块内的基因与表型进行相关性分析,目的是获得与缺血再灌损伤相关的核心基因,通过相关性分析获得10个模块中所有基因与表型的显著性,每个模块中所有基因与表型的显著性MS值均在0.8左右,且显著性P值为0.009,表明这10个模块中的基因与缺血再灌损伤密切相关(图3,C)。

为了进一步获得与缺血再灌损伤时间紧密相关的基因,借助STEM软件对差异表达的mRNAlncRNA进行时间序列分析,获得5个时间点中基因的所有变化趋势,其中每个profile对应一个矩形,带有颜色的profile符合显著变化趋势,每个矩形中的折线走势代表该profile中的基因变化趋势,结果显示6profile具有显著变化趋势, 表明这些profile中的基因与缺血再灌损伤时间紧密相关(图3,D)。

 







3 WGCNA和时序分析 

 

4. ceRNA调控网络分析

 

为了鉴定lncRNA靶向的mRNA,将lncRNA上下游1000kb内的mRNA作为靶基因,同时结合WGCNA分析中获得与缺血再灌损伤相关系数大于0.6mRNA构建lncRNA-mRNA调控网络,共获得42lncRNA-mRNA的关系对(图4,A);随后借助miRecode和starBase两款软件获得共有的预测lncRNA-miRNA关系对,接着基于miRTaeBase软件鉴定出lncRNA靶向的miRNA,然后获得miRNA 靶向的mRNA调控网络,将miRNA-mRNA与获得的lncRNA-mRNA进行关联分析,即获得miRNA-mRNA-lncRNA组成的ceRNA调控网络(图4,B),最后将参与ceRNA网络调控的核心mRNA进行功能分析。

由于只有SH2D3C和GTF2H4两个基因显著富集在响应细胞胁迫的GO term上,这两个基因存在的调控网络中共包含16个成员,即2lncRNA,2mRNA12miRNA,组成22个作用关系对(图4,C);结合该mRNA-lncRNA关系对对应的时间序列表达趋势,即在缺血再灌损伤12h后,该调控网络四个成员的表达量均达到最高;且SH2D3CmRNA RP11203J24。9lncRNA)与缺血再灌损伤表型负相关,而GTF2H4mRNA)和LINC00243lncRNA)与缺血再灌损伤表型正相关(图4,D)。

 








4 ceRNA调控网络


 

5. 体外验证实验

 

为了鉴定SH2D3CGTF2H4两个mRNA在缺血再灌损伤中发挥着重要功能,通过下调SH2D3CGTF2H4的表达,在体外进行缺氧再供氧损伤实验验证它们在缺血再灌注损伤中的功能,结果表明SH2D3CGTF2H4表达量降低,心脏微血管内皮细胞的活性在缺氧/复氧损伤过程中也明显降低(图5E-G)。

 






5 心脏微血管内皮细胞活性

 

文章亮点

 

    将DEMs和DELs注释富集分析,WGCNA以及时序分析结合筛选与表型时空特异性相关的核心基因。

 



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