【客户文章】2019-gut microbiota-自身免疫性肝炎中的肠道微生物组变化

  • 2019-11-04 13:10:41
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英文题目:Alterations of gut microbiome in autoimmune hepatitis

中文题目:自身免疫性肝炎中的肠道微生物组变化

期刊名:Gut microbiota       发表时间:20190525    IF17.943

DOI10.1136/gutjnl-2018-317836

相关产品16S rRNA V3-V4 微生物多样性

测序平台:MiSeq平台

样品来源:粪便 

 

研究背景:

自身免疫性肝炎(AIH)是一种慢性,免疫介导的肝脏疾病,其特征是肝细胞破坏,循环自身抗体的存在和血清中IgG水平升高。AIH在女性儿童和成人中比较常见,并且最近几年该病的发病率可能在逐渐增加。肝细胞活检在AIH的诊断中至关重要,这有助于排除其他疾病,评估肝脏炎症和纤维化,以利于制定治疗方案。一般而言,AIH对标准皮质类固醇治疗反应良好,而少数对此治疗无反应的患者可能很快会发生肝纤维化和肝硬化。虽然AIH与遗传和环境因素都有一定的关系,但其具体病因还尚不清楚。遗传易感人群中的肝脏抗原耐受性丧失认为由异生素病原体等环境因素引起。在描绘AIH结构研究人员已经做出很大努力,但只有主要组织相容性复合物(HLA)中的风险位点被赋予了易感性。证据是肠道微生物群具有比人类基因组更多的基因, 已经成为通过肠-肝轴发展肝脏疾病的关键环境因素。小鼠模型为肠道微生物群参与AIH的发病机制提供了初步证据。

最近一项研究通过16S rDNA技术比较17AIH15种对照人群间口腔微生物群,确定了3种与AIH相关的属,并研究了微生物群与唾液炎性细胞因子的相关性。鉴于研究的小群体,因此现有工作可能不能获得足够数据来探究微生物结构的改变。在本实验中,我们一个新的诊断AIH的大型和充分表征的队列中严格分析了肠道微生物组的结构,在类固醇治疗之前收集用于肝脏活组织检查的样本组织学数据。我们的研究结果有助于确定AIH的肠道微生态失调与疾病严重程度的相关性。最后我们还提出了一种用于区分AIH状态的微生物特征模型。




材料与方法:

1试验设计样品采集

挑选119接受过皮质类固醇激素治疗的AIH患者纳入研究。 其中69名患者在入组前服用熊去氧胆酸(UDCA)至少2周。48名患者在入组前1个月内接受过1的抗生素治疗,因为他们进行肝脏活检。选择了132名健康人作为对照。首先,我们对91名未接触过类固醇的AIH患者和98名健康人进行了比较研究。随后,另外用28未接受类固醇激素治疗AIH患者和另外34名健康验证结果。收集得到粪便样品在取样后3小时内在-80℃下冷冻保存。

2肝组织检查

对实验组和验证119AIH患者90进行肝组织检查。诊断AIH的典型特征包括界面性肝炎,门脉管中的淋巴细胞/淋巴浆细胞浸润,子宫和肝玫瑰花结形成。根据Scheuer系统评估炎症和纤维化的严重程度:炎症分级为0-4,纤维化分期为0-4

3DNA提取16S rRNA测序

DNA提取采用Fast DNA Stool Mini KitQiagenCaliforniaUSA)。通过PCR扩增rRNA V3-V4区域MiSeq平台测序

416S rRNA测序的生物信息学分析

使用Quantitative Insights Into Microbial EcologyQIIME2 V。2018。2)分析16S rRNA测序数据。使用QIIME2中的DADA2软件质控。然后,我们将序列按照97%的相似性进行聚类随后比对Greengenes数据库(V.13.8)进行物种注释。为了降低假序列的影响,我们删除了序列数目小于总序列数目0.005%的OTU。在质控过滤后,每个样本平均获得32708readsmin20178; max42988 )。然后使用MAFFT对序列进行比对,并使用Fast-Tree生成系统发育树。使用q2-多样性对测序深度为20178样品进行α和β多样性分析。如前所述,通过PICRUSt软件从16S rRNA序列推测肠道微生物组的宏基因组。

5数据分析

我们应用LEfSe不同分类学水平比较AIH患者和健康间的差异菌。该方法首先使用Kruskal-Wallis检验来获得具有组间具有显著差异物种,然后使用LDA判别分析研究差异样品分组的影响程度。使用多元线性模型算法(MaAsLin)进行研究协变量(年龄,性别,BMI,抗生素和UDCA)与微生物类群间相关性.使用用RV.2.15.3)语言进行数据统计分析。物种相对丰度回归试验glm函数)之前转化反正弦平方根进行计算。选择11AIH相关属进行模型构建。使用ROC进行模型优劣验证。其他统计分析包括Fisher精确检验,Kruskal-Wallis检验和Spearman相关性分析(PResiduals包)。

 

研究结果:

1、 1、未接受过类固醇激素治疗的AIH患者

我们研究119AIH患者132名在年龄、性别和BMI均与AIH患者匹配的健康人粪便菌群。所有入选的患者需要在接受固醇激素治疗前提供粪便样本。119例患者中有90例接受了肝脏活检,进而肝脏病变进行了表型分析。根据受试者登记顺序,将整个群组分成发现小组(AIH91;对照:98)和验证小组(AIH28;对照:34)。 表1列出了各小组的详细分组,临床指标和肝脏组织学特征等数据。




1、 2、AIH患者肠道中微生物α多样性降低菌群组成改变

在发现小组中,通过观察Shannon指数OTU,发现AIH患者微生物多样性和丰富度均显著降低(分别为p = 0.0041p = 0.0018Wilcoxon秩和检验;图1A)。为了评估微生物组成的总体多样性,我们基于unweighted UniFrac距离算法进行了PCOA分析,结果显示AIH患者与健康人的肠道菌群组成上存在着显着差异(伪F3.31p = 0。002,图1B)。基于weighted UniFrac距离Bray-Curtis距离算法进行分析同样发现两组之间的微生物群落组成存在显著不同(伪F2.72,p = 0.018;伪F2.35p = 0.002)。


3AIH患者和健康肠道差异菌

我们对具有91AIH患者和98名健康人肠道微生物菌群进行LEfSe分析。发现AIH患者和健康人肠道中相对丰度最高拟杆菌门和厚壁菌门。然而,由2A,两组微生物组成在水平没有显著变化。在属水平上,观察到了差异(参见在线补充图3)。经过LEfSE分析发现不同分类学水平上两组间共有15差异LDA评分> 2.0p <0。05)。在调整年龄,性别和BMI这些协变量后,仍11个差异菌(图2B)。在AIH患者肠道发现梭菌,RF39Ruminococcaceae,Rikenellaceae,Oscillospira,ParabacteroidesCoprococcus相对丰度降低 VeillonellaKlebsiellaStreptococcusLactobacillus的相对丰度增加。最值得注意,本研究PBS和原发性硬化性胆管炎(PSC)相关的Veillonella属在AIH患者肠道中显著富集(p = 2.28E-6LDA评分= 4。15)。由2C,我们推测Veillonella可能Veillonella dispar相关联(p = 8.85E-8)。为了进一步验证结果,通过控制年龄,性别,BMI,抗生素使用和UDCA治疗的影响因素,进行多变量分析(MaAsLin),发现上述获得11差异菌仍然7两组间存在差异p <0.05,见在线补充表1)。再次说明,VeillonellaAIH疾病显著相关p = 0.0014)。



4基于肠道微生物组的特征区分疾病状态

我们接下来评估了使用肠道微生物群作为生物标志物的潜在价值。首先,仅使用Veillonella属作为biomaker,进行ROC分析,发现AUC值为0.7。此外,AIH相关的属进行多变量逻辑回归分析,以获得能最佳区分AIH与健康的菌属。发现VeillonellaLactobacillusOscillospiraClostridiales这四个属可以区分AIH患者与健康AUC0.78(图3AC)。然而,使用所有11个属并未显着改善预测性能(AUC0。78)。使用MaAsLin证实的7个属的AUC0.74。然后利用验证组进行模型验证,发现单独的Veillonella验证AUC0.69。使用上述四个属进行ROC分析,发现AUC值增加至0。81,然而用11个与AIH相关的属进行ROC分析,发现AUC0。78。作为由MaAsLin验证获得的七个属的组成的模型,发现AUC0.81(图3B)。因此,Veillonella,LactobacillusOscillospiraClostridiales的组合对AIH患者具有潜在的高诊断价值。


5、肠道微生物与AIH疾病之间的相关性

基于Spearman相关性检验方法在考虑年龄,性别,BMI,抗生素和UDCA的使用情况,研究了临床指标和未使用过固醇AIH患者疾病相关联菌属之间相关性(图4A)。我们发现Veillonella属与天冬氨酸氨基转移酶(AST)呈显著正相关(r = 0.216p = 0.022)。我们进一步研究V. dispar,发现该物种与AST有更明显的相关性(rho = 0。266p = 0.005)。然后根据V. dispar的中位数水平对AIH样本进行二分法,发现具有高丰度V. disparn = 60)的AIH患者较低丰度V. disparn = 60)的AIH患者的血清AST水平增加2倍。 p = 0.010Wilcoxon秩和检验,图4B)。在AIH患者中,肝脏组织学在诊断和评估疾病严重程度方面起着关键作用。在本试验,通过研究90患者肝脏组织学数据,可以使我们深入探索肠道微生物群与AIH疾病严重程度间的相关性。27名患者有轻度/中度(0-2级)炎症,63名患有严重(3-4级)炎症;36例患者为轻度/中度(0-2期)纤维化,54例为严重(3-4期)纤维化(见在线补充表2)。研究发现,α多样性或β多样性与患者的炎症分级或纤维化分期无显著相关性(参见在线补充数字45)。此外,我们没有发现任何与晚期纤维化相关的AIH相关属。有趣的是,只有轻度/中度炎症等级的患者与严重炎症等级的患者间的Veillonella相对丰度是显著不同的(p = 0.044Wilcoxon秩和检验,图4C)。并且,V. dispar在晚期炎症的病人中更为丰富(p = 0.013,Wilcoxon秩和检验,图4C),强调了其具有作为推测肝脏活检结果潜力。然而,这些发现不能承受控制协变量的线性回归分析。


6AIH中的微生物功能失调

为了研究AIH和健康间肠道微生物群落的功能和代谢变化,我们使用PICRUSt预测肠道微生物群的功能。 通过LEfSe分析确定了AIHn = 119)和健康n = 132)间32KEGG代谢通路存在显着差异(LDA评分> 2.0p <0.05)。在用MaAsLin控制混杂因素后,两处理仍然17个功能存在显著差异(p <0.05,图5)。值得注意的是,我们发现诱导促炎因子分泌脂多糖似乎在AIH组较健康组过度表达,这可能是AIH中观察到较高水平TNF-α和IL-6原因。此外与多种氨基酸代谢相关的功能模块也发生了改变。例如,涉及色氨酸代谢和赖氨酸降解的途径在AIH的微生物组中是增加的,而精氨酸和脯氨酸代谢是降低。谷胱甘肽代谢也在AIH微生物组中高度富集。此外,在AIH组中,细菌趋化性显着降低。




研究结论:

本研究对AIH患者的肠道微生物组进行了全面调查,并提供了对疾病发病机制的新见解,提高了在判断AIH疾病中使用非侵入性生物标志物的可能性。

 

 

参考文献

Wei Y, Li Y, Yan L, et al. Alterations of gut microbiome in autoimmune hepatitis[J]. Gut, 2019: gutjnl-2018-317836.


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